环氧合酶-2衍生物塞来昔布对人肝癌细胞侵袭转移能力的影响

内容可：借此探讨外环氧合酵素-2衍生物塞来昔布对人肾脏癌SMMC-772l梗胞内来袭移转到战斗能力的直接影响，为塞来昔布在临床上病人肾脏获引理应。方法有应用肾脏梗胞内指导技术指导人肾脏肿瘤梗胞内株SMMC-7721，并以重修基底凝胶的来袭飞行测试、趋化民族运动飞行测试、对层粘连梗胞内的中空洞飞行测试以及损坏刮擦筛选观察有所不同ppm塞来昔布对人肾脏癌SMMC-7721梗胞内来袭、移转到战斗能力的直接影响。结果塞来昔布效用以人肾脏癌SMMC-7721梗胞内后，其梗胞内带电叛将相比上升，而民族运动消除叛将及来袭消除叛将相比上升，与比对分组相比相负仅有有流行病学意义，且塞来昔布ppm与梗胞内带电叛将，民族运动消除叛将及来袭消除叛将仅有有负异性。结论外环氧合酵素-2衍生物塞来昔布能相比消除人肾脏癌SMMC-7721梗胞内的带电、民族运动及来袭战斗能力，故可阻抑肾脏肿瘤梗胞内的移转到，也许是预防肾脏癌罹患的举足轻重候选药物之一。

肾脏癌的来袭移转到是造成了肾脏癌病人病情罹患和被害的主要原因。积极探索堵塞肾脏癌来袭移转到的有效途径，已是大幅度降低其被害叛将的冀望。随着外环氧合酵素-2(COX-2)在引发里举足轻重地位的确认，COX-2衍生物能否用以临床病人肾脏癌正逐渐已是深入研究的焦点。本深入研究以肾脏指导的人肾脏肿瘤梗胞内株SMMC一7721为实例。观察COX-2衍生物塞来昔布对人肾脏癌SMMC一7721梗胞内来袭战斗能力的直接影响。赞扬塞来昔布用以临床肾脏癌病人的也许性。为其临床应用获引原理基本和方法有学依据。

1 物料和方法有

1.1物料

人肾脏肿瘤梗胞内株SMMC一7721、NIH／3T3梗胞内株由本深入研究小分组保存，塞来昔布为辉瑞该公司其产品，Boyden泽田订制Millipore该公司。指导液GIBCORRL该公司其产品，胎牛毒素湖州四季青生物该公司其产品，酵素标仪BIORAD该公司其产品。Matrigel(人工基底凝胶胶)订制BD该公司

1.2梗胞内指导和药品配制

人肾脏癌SMMC-7721梗胞内株，肾脏传代指导，用所含10％胎牛毒素(FBS)的RPMI 1640指导液，置于37℃、5％CO2梗胞内指导箱里指导48 h，每24 h换指导液1次。待指导瓶底铺满肾脏肿瘤梗胞内后，弃去指导液，用0.25％胰梗胞内酵素新陈代龚SMMC-772l肾脏肿瘤梗胞内，所含10％胎牛毒素的RPMI 1640指导液调整梗胞内ppm为lxl06／ml。引近似生长期梗胞内用以筛选。将塞来昔布溶于灭菌的DMSO，塞来昔布储存液ppm分别为20、60、100μmol/L，的工作液，分设0μmol/L为比对。

1．3 SMMC-7721梗胞内与没多久的带电筛选

以每中空50 μg/mL FN溶液40μl一个大96中空梗胞内指导框。4℃下避光过夜。引lxl06/ml的SMMC-7721人肾脏肿瘤梗胞内水痘于已一个大FN的96中空指导框里。每中空100μl，分设5个复中空。筛选分组将塞来昔布ppm为20、60、100μmol/L 3个浓度分组加人，不加塞来昔布为比对分组，以指导液替换SMMC-7721梗胞内分设为空白比对分组。置于37℃、5％CO2饱和湿度下的指导箱内幼鸟2 h。停止不远处置后，PBS溶液冲洗两遍，重新加入100μl/中空0．5％混合物绿染液，切片10min。PBS溶液冲洗4次，37℃干燥，每中空重新加入1％醋酸乙醇100μl，混匀后加水10 min。在酵素联仪光波570nm光波不远处辨认出各中空种会光度参数(OD)，按下列公式计数梗胞内带电消除叛将：消除叛将(％)=1-(筛选分组OD-空白比对分组OD)/(比对分组OD-空白比对分组OD)x100％。

1．4梗胞内的移入筛选(损坏刮擦筛选)

将近似生长期SMMC-7721人肾脏肿瘤梗胞内水痘于12中空指导框里，过渡到梗胞内单层。用移液器滴头沿指导框底部方形“一”字形样单层指导梗胞内,镜下记录样第一区相对距离，改用截面积分将近为1％胎牛毒素的RPMI1640指导液,指导24 h改用截面积分将近为10％胎牛毒素的RPMI 1640指导液，继续指导48h，观察并照相。每分组直角4个样本。筛选重复3次。

1．5梗胞内来袭筛选

参阅Albini等[2]所用方法有，将作为有机化学趋锌的NIH3T3梗胞内指导上清液0.2 ml重新加入Boyden泽田的下过道，在上下过道之间用中空径8μm的聚丙烯索科利夫卡滤凝胶分开，该凝胶先行铺上Madrigel溶液40μl(所含Matrigel 120μg)，并在37℃单体30 min以重修基底凝胶。将所含ppm分别为20、60、100μmol/L的梗胞内悬液200μl加到Boyden上过道里，在37℃、5％C02指导箱幼鸟6 h后引出滤凝胶，擦尽凝胶上Matrigel及未穿行的梗胞内。甲醛固定1min，HE切片。200倍透镜成像下随机记将近5个视野穿行聚丙烯凝胶的梗胞内将近，引线性，结果以消除叛将指出。分设不加塞来昔布为比对分组，每分组分设5个直角Boyden小塞。消除叛将=[(比对分组穿凝胶梗胞内将近-筛选分组穿凝胶梗胞内将近)／比对分组穿凝胶梗胞内将近]x100％。

1．6梗胞内肾脏民族运动筛选

聚丙烯索科利夫卡滤凝胶先行不铺上Madrigel溶液，其余同梗胞内肾脏来袭筛选。

1．7流行病学不远处置

所有将近参数仅有以仅有将近±标准负指出，分组间相负比起采用t筛选。P

2 结果

2．1塞来昔布对SMMC-7721与FN带电的直接影响(备注1)

备注1 塞来昔布对SMMC-7721梗胞内与FN带电消除叛将的直接影响（%）*指出各筛选分组间比起P

人肾脏肿瘤梗胞内SMMC-7721与纤连梗胞内之间带电力强，塞来昔布效用2 h后。梗胞内带电战斗能力相比上升。各浓度分组与比对分组相比起，相负仅有有预测参数(p

2．2塞来昔布对SMMC-7721梗胞内移入的直接影响

损坏刮擦筛选显示，比对分组梗胞内样第一区72 h着有大量梗胞内转到，而塞来昔布分组的梗胞内移入却不相比(示意图1)，指引塞来昔布对肾脏肿瘤梗胞内的移入有相比的消除效用。

示意图1 损坏刮擦筛选检测梗胞内移入战斗能力A：比对分组；B：塞来昔布不远处置分组

2．3塞来昔布对SMMC-7721梗胞内来袭、民族运动战斗能力的直接影响(备注2)

筛选各浓度分组与比对分组对梗胞内来袭、民族运动战斗能力的直接影响比起，梗胞内来袭、民族运动引参数及消除叛将相负具预测参数意义(P

*指出各筛选分组间比起及筛选分组与比对分组比起P

3 讨论

来袭移转到是举足轻重的生物学外观上，也是病人里面临的最大的难题和保健全面性。Liotta等[3]提出恶性来袭的三步学说，第一步梗胞内与梗胞内外基质(ECM)中空洞；第二步梗胞内本身或正向肠道梗胞内分泌梗胞内酪氨酸分解基质；再一一步即趋化介导的梗胞内民族运动和移入。

持续发展深入研究发掘出，COX-2在多种新陈代龚道里过传达[4、5]，且与肾脏梗臌癌的引发、发展和HRS联系密切。Koga[6]等检测44举例外科手术切除的HCC分组织起来与癌正对面非癌分组织起来及7举例正常肾脏分组织起来里COX-2的传达，结果发掘出很低其发展的HCC较低其发展的HCC或癌正对面非癌分组织起来COX-2的传达相比增强，癌正对面非癌分组织起来上皮梗胞内里COX-2方形散在强传达，正常肾脏分组织起来COX-2方形弱阳性传达。Kondo等[7]深入研究发掘出，HCC病人外科手术切除后,残留肾脏分组织起来里COX-2很低传达会促使肿瘤梗胞内更极易引发微移转到而使其设法共存和蔓延,造成了肾脏癌的罹患，指引HCC的HRS负，也许与COX-2的很低传达有关。Abiru等[8]发掘出上皮梗胞内生长因子(HGF)可以通过加强来袭而慢速肾脏肿瘤梗胞内移转到，应用吗啡或NS-398，一种特异性COX-2衍生物，却可以减轻HGF对HepG2的这种效用而不直接影响梗胞内的共存战斗能力。这些深入研究结果为软性COX-2衍生物应用以肾脏癌的保健获引了理应。

本深入研究带电筛选备注明，筛选各浓度分组塞来昔布对肾脏肿瘤梗胞内与FN带电叛将与比对分组比起，相负具预测参数意义，概述塞来昔布能消除SMMC-7721梗胞内带电。此外，在来袭与移转到的操作过程里，梗胞内须要穿行腹腔、腔静脉的基底凝胶才能转到腹腔和腔静脉。达到移转到的借此。因此肿瘤梗胞内所致趋化状况趋化并穿行基底凝胶的战斗能力是来袭和移转到的关键状况之一。我们采用NIH／3T3上清作为趋化状况，Matrigel作为人工基底凝胶构建Boyden来袭泽田，梗胞内带电于人工基底凝胶后，新陈代龚分解基底凝胶并在趋化状况正向下穿行基底凝胶，再一附着在滤凝胶另一面。从而通过计将近梗胞内将近看出梗胞内来袭战斗能力。本深入研究备注明塞来昔布对SMMC-7721梗胞内来袭、民族运动仅有具消除效用。

从以上筛选结果我们可以看到塞来昔布对SMMC-7721梗胞内的带电、民族运动、来袭战斗能力仅有有相比的消除效用，从而阻抑梗胞内的移转到，为临床上塞来昔布保健肾脏癌的移转到获引了理应。

参考文献：

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[7]Kondo M，Yamamoto H，Nagano H，et a1．Increased expression of COX-2 in nontumor liver tissIIe is associated with shorter disuse-free survival in patients with hepatocellular carcinoma[J]．Clin Cancer Res，1999，5(12)：4005,12．

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编辑： 丽芳